四川大学赵行/曾昕/刘江Mater. Today：pH响应型双功能水凝胶，集局部递送和抗癌活性于一体，高效治疗口腔鳞状细胞癌

口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤，5年生存率为50% ~ 60%。作为OSCC综合治疗的一部分，常规化疗常因其高且不可逆的毒性作用和疗效不佳而受到阻碍。因此，开发局部化疗给药系统，既能在肿瘤部位维持较长时间的化疗药物治疗浓度，又能以最小的全身毒性获得较高的治疗效果。超分子水凝胶由于其固有的动态特性、可调节的理化性质、对难以到达的组织的高可及性以及良好的药物缓释能力，从而减少的给药频率，成为最受关注的局部递送载体。尽管的载药效率较低、药物包封工艺复杂、缺乏生物相关的刺激反应性仍是研究的难点。因此，开发一种pH响应性双功能水凝胶，将局部递送和抗癌活性整合在一个系统中，从而高效治疗口腔鳞状细胞癌将具有重要的基础和临床意义。

基于此，四川大学华西口腔医学院赵行教授、曾昕教授和刘江教授合作发现了一种基于pH响应的双功能isoG的超分子水凝胶，通过遵循简单和绿色的程序，在一个分子中成功地开发出了一种兼具局部递送和抗癌活性的超分子水凝胶（图1）。异鸟苷-苯基硼酸-鸟苷(isoGPBG)水凝胶具有优异的稳定性(超过一年)、优异的pH响应性和良好的缓释能力。体内外实验表明，isoGPBG水凝胶不仅具有良好的生物相容性和可降解性，而且能显著抑制肿瘤生长(抑制肿瘤生长约60%)并提高总生存期，尤其是在口腔鳞状细胞癌(OSCC)的临床前患者源性异种移植(PDX)模型中。因此，据研究者所知，isoGPBG水凝胶是第一个基于pH响应的双功能isoG超分子水凝胶，将局部递送和抗癌活性整合在一个分子中。isoGPBG水凝胶有望作为一种智能的双功能局部递送系统应用于临床肿瘤治疗。相关工作以“pH-responsive dual-functional hydrogel integrating localized delivery and anti-cancer activities for highly effective therapy in PDX of OSCC”发表在《Materials Today》。

图1. pH响应的双功能isoGPBG水凝胶在一个分子中集成局部递送和抗癌活性，用于OSCC PDX模型的高效治疗

稳定可注射的isoGPBG水凝胶的制备与表征

以等摩尔比的isoG、1,4-苯二硼酸(PBA)和G为原料，在不同碱金属离子溶液存在下，在超纯水或磷酸盐缓冲液(PBS)中，采用简单的一锅合成法制备IsoGPBG水凝胶(图2a)。经典的倒瓶试验用于评估水凝胶是否形成及其稳定性。在超纯水中，只有K+存在时才会形成透明水凝胶，称其为半凝胶更为合适。有趣的是，通过将PBS混合溶液在5分钟内冷却到环境温度，可以观察到一种强而稳定的水凝胶，可以描述为固体状凝胶(图2b)。

图2. 水凝胶的制备及其流变性能

在表征了isoGPBG水凝胶基本性质的基础上，对其交联机理进行了研究。三种成分之间的基本相互作用有助于isoGPBG水凝胶的形成。第一种是PBA中的羟基在isoG和G的核糖之间可逆地与顺二醇结合，形成环状苯基硼酸结构isoGPBG。第二种是isoG与isoG或G与G之间的hoogsteen型氢键的超分子相互作用，从而形成(isoGPBG)-四联体结构。最后一个重要的相互作用是(isoGPBG)-四联体之间的π-π叠加，形成纤维(isoGPBG)-四联体结构(图3a)。支持isoGPBG水凝胶连接方式的科学证据主要包括文献报道和我们的实验结果。苯基硼酸酯键在isoGPBG水凝胶的形成过程中起着至关重要的作用。isoG、G、PBA和isoGPBG水凝胶的傅里叶变换红外(FT-IR)光谱（图3b和c）。

图3. 水凝胶的表征

isoGPBG水凝胶具有优异的pH响应性

首先，研究者探索了isoGPBG水凝胶在不同pH条件下的isoG释放。值得注意的是，pH 6.8对应于肿瘤微环境的酸性条件，选择pH 4.0和pH 5.5分别模拟核内体和溶酶体的pH。将isoGPBG水凝胶浸泡于不同pH值(pH 4.0、5.5、6.8、7.4、8.4)的PBS中，测定其pH响应性，并与isoGBG水凝胶进行比较。无论是在酸性还是碱性pH条件下，isoGBG水凝胶都是先膨胀后坍塌的，这表明它们在酸性或碱性环境中都不稳定，不具有pH响应性，这与pH值小于9.24时硼酸酯键断裂相一致。然而，在酸性pH PBS中，isoGPBG水凝胶有固体沉淀(图4a)，而在碱性溶液中没有，表明isoGPBG水凝胶具有酸性pH响应性。同样，这一现象与苯基硼酸酯键在pH小于7.35时断裂一致。此外，在酸性PBS中isoGPBG水凝胶的沉淀被质谱证实为isoGPBG(图4b)，在相同的缓释时间后，酸性条件下的isoGPBG水凝胶的残留量比碱性条件下的少，表明isoGPBG水凝胶在酸性pH下降解较快。在第9天，isoGPBG水凝胶在pH值7.4时的累积释放百分比仅为38.31%，而isoGPBG水凝胶的累积释放百分比为76.66%。isoGBG水凝胶会释放出少量的isoG，这与我们观察到的水凝胶在不同pH条件下会膨胀一致。而isoGBG水凝胶在不同pH条件下的isoG释放无明显差异，再次证实了isoGBG水凝胶不具有pH响应(图4c)。在酸性pH条件下isoG的累积释放量大于碱性pH，证实苯基硼酸酯键在酸性环境下更容易断裂(图4d)。在酸性条件下isoG从isoGPBG水凝胶的较快释放与上述酸性PBS中isoG固体的沉淀一致。这些结果表明，isoGPBG水凝胶具有诱人的pH敏感性，可以智能地在肿瘤局部酸性微环境中递送isoGPBG。

图4. 出色的pH响应性

isoGPBG水凝胶通过诱导OSCC细胞凋亡具有显著的体外抗癌活性

研究者使用经典的细胞计数试剂盒-8 (cell counting试剂盒-8)检测了isoGPBG水凝胶在三种口腔癌细胞系(CAL-27, HSC-3和HSC-4)上的抗肿瘤活性，并与isoGPBG作为对照进行了比较。将上述细胞暴露于不同浓度的isoGPBG水凝胶中。研究者进一步评估了不同孵育时间的isoGPBG水凝胶的化疗效果。如图5a-5d所示，与PBS对照组相比，isoGPBG和isogg水凝胶均表现出对CAL-27、HSC-3、HSC-4细胞的抗增殖能力。

图5. isoGPBG水凝胶具有良好的体外抗癌活性

接下来，研究者对isoGPBG水凝胶的抗肿瘤机制进行了初步探索。考虑到isoG是isoGPBG水凝胶中发挥抗肿瘤作用的主要活性成分，研究者着重对isoG进行体外抗肿瘤机制的探索。首先，研究者用0.05 M isoG处理CAL-27细胞12 h，并以PBS作为对照，进行转录组测序和分析。结果显示，与PBS对照组相比，isoG处理CAL-27细胞共检测到2215个差异表达基因，其中下调基因796个，上调基因1419个(图6a)。然后对差异表达基因(DEGs)进行聚类分析，分析基因在不同组和样本中的表达模式。结果显示，isoG水凝胶处理组和PBS对照组之间存在独立的团簇(图6b)。

图6. isoG处理12 h后CAL-27细胞转录组测序分析结果

然后，研究者通过流式细胞术进一步探索了isoG可能的抗癌机制。流式细胞术检测结果证实，isoG在体外可通过诱导肿瘤细胞凋亡显著抑制肿瘤细胞生长(图7a)。显著的是，当isoG浓度从0.7 mg/mL增加到7 mg/mL时，CAL-27细胞的凋亡率从5.61%增加到50.02%(图7b)。此外，我们发现isoG通过缩短G0/G1期和S期，阻断G2/M期，从而干扰CAL-27细胞的正常细胞周期进程(图7c)。G0/G1期和S期随isoG浓度的增加而缩短(图7d)。1.75、3.5、7 mg/mL isoG水凝胶处理的CAL-27细胞平均G0/G1期比例分别为29.88%、31.68%、33.47%，PBS组为46.70%(图7e)。1.75、3.5、7 mg/mL isoG水凝胶处理CAL-27细胞的平均S比例分别为16.09%、25.12%、27.66%(图7f-g)。为了进一步研究isoG的抗癌作用机制，研究者通过TUNEL法检测了CAL-27细胞的凋亡。TUNEL检测显示，与对照组相比，isoG水凝胶处理组出现明显的凋亡细胞。随着isoG浓度的增加，这种效应变得更加显著(图7h)。如图7i所示，1.75、3.5、7 mg/mL isoG水凝胶处理CAL-27细胞的平均细胞凋亡率分别为20.97%、38.51%、70.50%。同时，pbs组CAL-27细胞的平均凋亡率仅为0.226%。研究表明，isoG水凝胶对CAL-27细胞具有良好的细胞毒性作用，诱导细胞凋亡。

图7. isoG对CAL-27细胞的体外抗癌活性与细胞凋亡有关

isoGPBG水凝胶在体内的视觉生物降解及生物相容性评价

一个优秀的治疗策略应该是有效的，并且没有毒副作用。良好的生物相容性和生物可降解性是水凝胶在体内应用的两个基本特性。通过BALB/c小鼠背部皮下注射isoGPBG水凝胶，评价其在体内的降解、生物相容性及水凝胶的形成。将isoGPBG水凝胶注射到小鼠背部皮下后不同时间点的样品宏观照片如图8a所示。小鼠局部皮肤注射后不久即膨出，膨出区域无色，说明注射后体内产生了水凝胶。PBS对照组局部皮肤无明显膨出，证实了isoGPBG水凝胶的可注射性。注射后4 d，未发现isoGPBG水凝胶，表明isoGPBG水凝胶在体内具有可生物降解性。

图8. isoGPBG的体内水凝胶形成、降解和生物相容性

isoGPBG水凝胶和isoG在体内的生物分布

通过对isoGPBG水凝胶局部给药后的行为进行评估，优化给药剂量和频率，并进行isoGPBG水凝胶的组织分布和体内药代动力学分析，以研究药物在皮肤和血液循环中的滞留。在单次皮下注射isoGPBG水凝胶(35 mg/kg)后以预定时间间隔从小鼠取血。皮下注射后局部皮肤检测到高浓度的isoG(图9a)。皮下注射isoGPBG水凝胶后，isoG在皮肤血浆、脑、肌肉、心、肝、脾、肺、肾、胃和肠中的分布如图9a所示。IsoG在皮下给药后在上述所有组织中均有检测到，并在5 min内迅速分布。注射部位皮肤的IsoG浓度最高，其次是肝、肾、心、脾、肺、肠、肌肉(图9a、9b)。因此，除皮肤外，肝脏和肾脏是isoG的主要靶器官。在72 h时，局部皮肤中仍可检测到isoG，说明皮下注射后isoGPBG水凝胶可以实现缓释(图9c)。

图9. isoGPBG水凝胶和isoG在体内的生物分布

isoGPBG水凝胶的体内抗肿瘤作用

研究者使用CAL-27 CDX模型进一步检测了isoGPBG水凝胶的抗肿瘤效果。当肿瘤体积达到约50 mm3时，携带CAL-27异种移植瘤的裸鼠每周接受3周的瘤周注射PBS、5-氟尿嘧啶(5-FU)、isoG或两种不同浓度的isoGPBG水凝胶(35和17.5 mg/kg)(图10a)。5-FU是临床实践指南(Head and Neck cancer, Version 2.2022, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology)推荐的首选一线治疗方案，而DOX是其他推荐的干预措施(指可能疗效稍差、毒性较大或基于较不成熟数据的其他干预措施;或对于类似结局，费用显著较低)。因此，5-FU被用来检测体内抗肿瘤效果。将小鼠的肿瘤切除以进行进一步测量(图10b)。如图10c和d所示，PBS处理的小鼠肿瘤生长迅速且不受限制，在21天结束时，平均肿瘤大小约为初始肿瘤大小的9.4倍。PBS组、5-FU组和isoG组之间差异无统计学意义。值得注意的是，isoGPBG水凝胶组肿瘤生长缓慢，两个水凝胶组与对照组相比具有显著差异。35 mg/kg isoGPBG水凝胶的治疗效果优于17.5 mg/kg。与PBS组相比，35和17.5 mg/kg isoGPBG水凝胶的抑瘤率分别为69.53%和59.57%。与isoG组相比，2个浓度的isoGPBG水凝胶的抑瘤率分别为60.03%和46.96%。同时，在实验期间持续监测小鼠的体重。令人印象深刻的是，isoGPBG水凝胶组小鼠的体重与对照组小鼠相似，在三次注射后没有明显的体重下降，这表明isoGPBG水凝胶在体内耐受良好，没有严重的毒性和副作用(图10e)。isoGPBG水凝胶可作为OSCC体内有效局部化疗的潜在平台。

图10. isoGPBG水凝胶的体内抗肿瘤作用

【小结】

总之，研究者设计并成功开发了一种响应pH值的双功能isoGPBG水凝胶，该凝胶通过绿色和简单的策略将局部递送和抗癌活性集成在一个分子中。一般来说，一个系统的开发越简单、越容易，它到达诊所的机会就越好。isoGPBG水凝胶具有优良的成胶特性和稳定性，良好的机械性能和优异的pH响应性。如上所述，isoGPBG水凝胶的独特特性与生物组织非常相似，为其生物医学应用奠定了基础。酸性肿瘤微环境中苯硼酸酯键的破坏是isoGPBG水凝胶中isoG的pH响应性释放的原因。在体外实验中，isoGPBG水凝胶在OSCC细胞中表现出出色的抗癌性能。此外，isoGPBG水凝胶在体内具有良好的生物相容性和生物降解性。因此，体内抗肿瘤试验证明了cdx荷瘤小鼠模型和两个独立的临床前PDX模型具有潜在的抗肿瘤活性，适合临床前研究。此外，isoG在体内良好的缓释和组织分布，为isoGPBG水凝胶的临床前应用提供了理论依据。最引人注目的是，据研究者所知，isoGPBG水凝胶是第一个结合局部递送和抗癌活性的pH响应双功能isoG水凝胶的例子。因此，这种响应pH值的双功能水凝胶有望为提高口腔癌管理开辟新途径，提供新策略。

封面来源：图虫创意