​昆士兰大学赵春霞教授/南洋理工高华健院士《PNAS》：纳米颗粒弹性调节细胞膜包被纳米颗粒的形成及其纳米生物相互作用

纳米粒子(NPs)已被探索作为药物递送和肿瘤靶向的一个有前景的平台。细胞膜涂层纳米粒子近年来引起了人们的极大兴趣。传统纳米粒子具有一系列吸引人的固有性质，包括可调粒径和表面性质。一个重要的发展是，纳米粒子的细胞膜涂层保留了源细胞的表面特性，提供了许多额外的优势，如更长的循环时间和更好的靶向性。各种各样的细胞膜已经被用于制造各种膜涂层的纳米粒子，这些纳米粒子保留了源细胞的独特生物功能。然而，这一发展仍处于早期阶段，仍有两个关键问题有待解决。首先，细胞膜包被过程是否可以将所有完整状态的膜蛋白转移到NP核心上，并保持其结构和功能?其次，NP核心固有的理化性质对被膜后的膜蛋白谱和完整性有什么影响，以及如何影响被膜的NP与其他细胞的相互作用?

基于此，澳大利亚昆士兰大学生物工程和纳米技术研究所赵春霞教授、南洋理工大学高华健院士和昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所Michael S. Roberts教授合作合成了两种间充质干细胞(MSC)膜涂层二氧化硅纳米粒子(MCSNs)，它们的尺寸相似，但刚度值(MPa和GPa)明显不同。出乎意料的是，与硬MCSNs相比，软MCSNs的巨噬细胞摄取低得多，而癌细胞摄取高得多。有趣的是，研究者发现软的MCSNs能够形成更富含蛋白质的膜涂层，并且涂层具有高含量的MSC趋化因子CXCR4和MSC表面标记CD90。这导致软MCSNs通过CD90/整合素受体介导的通路和CXCR4/SDF-1通路增强癌细胞的摄取。这些发现为研究者理解如何利用纳米颗粒弹性和膜涂层的结合来促进生物-纳米相互作用提供了重要的一步，并为开发更有效的癌症纳米药物铺平了道路。相关工作以“Nanoparticle elasticity regulates the formation of cell membrane-coated nanoparticles and their nano-bio interactions”发表在《PNAS》。

图1. MCSNs的合成及其表征

软、硬MCSNs的合成

研究者首先合成了二氧化硅纳米囊(SNs)作为纳米核。简而言之，不同硬度的SNs是通过该实验室开发的纳米乳液模板法制备的。利用设计的肽SurSi (AcMKQLAHSVSRLEHARKKRKKRKKRKKGGGY-CONH2)形成水包油纳米乳剂。然后，将二氧化硅前体三乙氧基乙烯基硅烷(TEVS)或四乙氧基硅烷(TEOS)添加到纳米乳液中，以启动生物矽化，从而形成油核二氧化硅壳纳米囊(图1A)。二氧化硅前体TEVS诱导软SNs的形成，而TEOS允许硬SNs(20)的形成。SNs的硅壳由约18 wt%的SurSi肽组成。然后将这些制备好的SNs聚乙二醇化以筛选表面电荷，因为带正电荷的NPs会与带负电荷的细胞膜相互作用，导致挤压期间的聚集。PEG密度为约0.9分子/nm2。为了获取MSC细胞膜，干细胞在低渗溶液中溶解，然后使用超声破碎。通过离心和挤压形成MSC膜囊泡。最后，将聚乙二醇化SNs与MSC膜囊泡共挤出形成MCSNs(图1B)。

图2. MCSNs与巨噬细胞或癌细胞的相互作用，以及MCSNs的表面性质

巨噬细胞摄取实验

NPs的免疫逃逸对于改善其血液循环和肿瘤蓄积至关重要。由于低免疫原性和主要组织相容性复合物分子的低表达，MSC涂层已被证明能够阻止NPs被免疫系统识别。因此，保留MSC膜蛋白的MCSNs有望表现出巨噬细胞摄取减少。通过RAW264.7巨噬细胞对MCSNs的摄取，研究MCSNs的免疫逃逸效应。首先，我们制备了双荧光标记的MCSNs，以阐明其内化过程。采用DiI (549/565 nm)、CFSE (492/517 nm)和Hoechst 33342 (343/361 nm) 3种荧光染料分别标记SNs、MSC细胞膜和巨噬细胞细胞核。将细胞与制备的MCSNs共孵育，共聚焦显微镜观察细胞形态。共聚焦图像(图2A)显示DiI和CFSE的荧光信号高度重叠，表明软的和硬的MCSNs在细胞摄取过程中保持完整。

NPs的硬度和表面性质对其癌细胞摄取的影响

研究者使用软的和硬的聚乙二醇化SNs以及MCSNs (44 MPa和2.3 GPa)来研究NP弹性对NP -细胞相互作用的影响(图2D)。由于非特异性NP-细胞相互作用，软的和硬的聚乙二醇化SNs都表现出类似的Huh-7癌细胞摄取，这表明NP刚度对其非特异性细胞摄取的影响最小，这与之前的研究一致。相比之下，无论是软的还是硬的MCSNs, Huh-7细胞的摄取均显著高于聚乙二醇化的SNs，证实MSC包被可以增强癌细胞的摄取。此外，软质MCSNs的摄取高于硬质MCSNs。

图3. HCC肿瘤特征示意图，包括肿瘤血管渗漏和致密ECM

研究MCSNs易位的内皮屏障模型

为了模拟HCC肿瘤微环境(图3A)，并探索纳米囊表面的MSC涂层如何影响癌细胞对MCSNs的摄取，研究者设计了两个基于transwell的模型。首先，为了研究MCSNs通过肿瘤内皮屏障的易位，研究者建立了一个受损的血管模型，将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养在transwell插入膜上，然后用TNF-α(39,40)诱导肝窦内皮损伤，从而增加窗孔的大小(图3B)。VE-cadherin免疫组化染色观察细胞间连接状态;刺激后，缝隙(几微米)开始出现(图3C)，其大小与体内观察到的相似。然后，研究者构建了transwell插入物细胞膜内皮屏障受损和孔底部Huh-7单层细胞的模型，以探索MSC涂层是否促进MCSNs的跨内皮转运(图3D)。在该模型中，将等量DiI标记的软、硬SNs和MCSNs加入到插入物中，孵育4 h。为了探究CXCR4对MSCs摄取的影响，我们使用不同CXCR4表达水平的MSCs (CXCR4阻断、CXCR4正常表达和CXCR4过表达)的细胞膜制备不同的MCSNs。流式细胞术定量检测细胞摄取结果显示，阻断或过表达CXCR4后，MCSN细胞摄取随相应细胞膜上CXCR4浓度的增加而降低或增加，提示CXCR4/ SDF-1轴在NPs的跨内皮转运中发挥重要作用。值得注意的是，即使是CXCR4阻断的纳米颗粒，其细胞摄取仍然显著高于聚乙二醇化纳米颗粒。这可能是由于另一种表面标志物CD90通过特异性受体介导的摄取途径增加了细胞摄取。此外，NP细胞通过非TNF-α处理的HUVEC层的摄取比TNF-α刺激组低2倍，表明肿瘤引起的血管受损和细胞间隙导致了NP从血管向肿瘤部位转移的增强。

细胞摄取过程中MCSN形态的透射电镜观察

为了进一步研究细胞摄取过程的机制，通过制备50 nm树脂切片并进行TEM成像，观察细胞摄取过程中MCSNs的形态。图4显示了软的和硬的MCSNs在细胞表面或核内体。在软的MCSN附近发现更多的碎片，表明软的MCSN在细胞摄取过程中更容易被剥离。MCSNs的特殊白色部分(如图4b, ii)是由于树脂切割过程中产生的孔。选取10个位于细胞膜上的MCSN，计算其长轴与短轴的尺寸比。观察到类似的形状转变(硬MCSN为1.092，软MCSN为1.119)。研究者还使用相同的方法研究了巨噬细胞对MCSNs的细胞摄取。软、硬MCSN均未观察到明显形变。值得注意的是，没有发现很多软MCSN，因为它们的细胞摄取是最小的。

图4. MCSNs与Huh-7肝癌细胞共孵育的TEM图像

理论研究

通过理论模拟来阐明硬度和特异性结合如何影响软、硬SNs的细胞摄取。根据实验得到的力-压痕深度曲线和薄壳变形的Reissner公式，确定了纳米胶囊材料的杨氏模量。假设在胶粘剂被细胞膜包裹的过程中，SNs发生轴对称变形(图5A)。以细胞膜弯曲刚度κ和膜张力σ为代表值，目前的理论结果与我们之前的理论研究一致，表明在简单的膜包裹过程中，仅用脂质膜几乎不能使固体薄壳纳米囊变形(图5B)。软、硬SNs的缠绕能量和构型差异很小，表明球形软、硬SNs的缠绕力学行为可以模拟为球形刚性SNs的缠绕，与透射电镜观察结果一致。

图5. 理论研究

【小结】

研究者报告了NP硬度在调节被细胞膜包裹的NP形成、被膜的蛋白质谱以及NP -细胞相互作用中的关键作用。与硬MCSNs相比，软MCSNs倾向于形成含有更多蛋白的膜涂层，从而形成更高密度的特定受体(在我们的研究中CXCR4和CD90)，导致更高的癌细胞摄取。研究者建立了两个体外模型来证实CXCR4/SDF-1轴在通过内皮屏障和ECM增强肿瘤靶向性中的重要作用。该发现为细胞膜包被的纳米粒子的性质提供了有价值的见解，也为MSC膜包被如何促进癌细胞摄取提供了基本的理解。在这项工作中，研究者主要关注体外生物-纳米相互作用。这些纳米胶囊可以在制备水包油纳米乳之前将其溶解在油相中，从而在油芯中负载疏水有效载荷，并有可能用于癌症治疗，未来的系统体内研究包括循环时间、生物分布、药代动力学、药效学、毒性和清除将是开发有效的细胞膜涂层纳米粒子用于靶向癌症治疗的关键。

封面来源：图虫创意